Lab. Praktikum Bio 2

Anggota/NRP : Miftahul Janah/G34070096                          Asisten   : Ucu Riyantini Maulida

Eko Hadi/G34061760                                   MK         : Kultur Jaringan Tanaman

PEMBUATAN LARUTAN BAKU MEDIUM MS (MURASHIGE DAN SKOOG)

PENDAHULUAN

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril (Gunawan 1987).

Medium yang digunakan dalam kultur in vitro tanaman dapat berupa medium padat atau cair. Untuk memudahkan pembuatan medium kultur sebagian besar komponen disiapkan dalam bentuk larutan beku. Bahan seperti sukrosa, agar, dan beberapa komponen tertentu tidak dibuat larutan baku, tetapi langsung ditambahkan ke dalam campuran untuk pembuatan medium.  Medium padat umumnya digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi membentuk tanamanyang lengkap (planlet), sedangkan medium cair biasanya digunkan untuk kultur sel. Media tumbuh dapat mengandung lima komponen utama yaitu senyawa anorganik (unsur makro dan unsur mikro), zat pengatur tumbuh, sumber karbon, vitamin, dan suplemen organik. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dan sebagainya. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS (Yuwono 2008).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui teknik aseptik dalam bekerja di dalam laboratorium kultur jaringan, mengetahui cara membuat larutan baku untuk pembuatan media MS secara umum, dan terampil dalam mempersiapkan dan bekerja dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC).

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah botol kultur, gelas piala, skalpel, bunsen, pinset, pipet, erlenmeyer, LAFC, batang pengaduk, autokaf, pH meter, labu ukur, dan alat tulis. Bahan yang digunakan adalah media MS, aquades, tisu, alkohol 70% dan 95%, KOH/KCl, alumunium foil.

METODE

Pembuatan media MS. Larutan baku dibuat, labu ukur 1 liter diisi sepertiga dengan aquades. Larutan baku satu persatu ditambahkan ke dalam labu ukur. Campuran diaduk ditiap penambahan larutan baku. Sukrosa dan bahan-bahan lain yang diperlukan ditimbang, kemudian diaduk sampai larut. Aquades ditambahkan sampai volume 1 liter. Campuran dipindahkan ke dalam erlenmeyer besar. Sambil diaduk KOH/HCl 1N diteteskan sampai pH mencapai 5,6-5,8 dengan bantuan kertas pH. Setelah itu, agar-agar ditambahkan ke medium dan diaduk sampai merata, dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk. Medium dituangkan ke dalam botol kultur dan ditutup dengan plastik. Selanjutnya, media diautoklaf dan disimpan dalam ruang kultur.

Cara mempersiapkan dan bekerja di dalam LAFC untuk tanaman padi. Meja dan dinding LAFC diseka dengan tisu dan alkohol 70%. Botol kecil berisi alkohol 95% ditutup dengan Al-foil, beberapa botol kultur, kotak stainless steel berisi pinset, pisau skalpel, dan lain-lain serta media kultur dalam LAFC disiapkan. Lampu UV dinyalakan minimal 15 menit dengan LAFC dalam keadaan tertutup rapat. Setelah lampu UV dimatikan, lampu neon dan blower dinyalakan, pintu LAFC sudah dapat dibuka sebagian atau seluruhnya. Sebelum tangan masuk kedalam LAFC, tangan sampai bagian siku disemprot dengan alkohol 70%. Alat-alat seperti pinset, skalpel, gunting yang diperlukan untuk pembuatan kultur diselupkan dalam alkohol 95% dan dibakar dengan api bunsen. Setelah itu, alat diletakkan di atas tutup kotak stainless steel dan dibiarkan dingin. Alat yang telah dingin dapat dipakai dan setelah digunakan langsung dicelup, dibakar, dan didinginkan kembali.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Komponen yang diperlukan untuk kultur jaringan tanaman terdiri dari unsur makro, unsur mikro, pengkelat besi, vitamin, sumber karbon dan zat pengatur tumbuh. Unsur makro yang diperlukan antara lain nitrogen, phospor, kalium, magnesium dan sulfur. Unsur mikro yang diperlukan yaitu besi, mangan, seng, boron, copper, molibdenum dan klor (Dods dan Robert 1995). Pengkelat besi seperti NaEDTA sangat diperlukan dalam pelarutan sumber besi (Fe). Selain itu EDTA memberikan pengaruh terhadap sistem enzim dalam morfogenesis kultur. Vitamin memiliki fungsi sebagai katalis dalam sistem enzim dan hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit. Jenis vitamin yang umum digunakan adalah thiamin, niacin dan pyridoxin (Dods dan Robert 1995). Sumber karbon dalam media diperoleh dari penambahan sukrosa atau D-glikosa dengan konsentrasi 20-30 g/l. Myoinositol merupakan karbohidrat yang digunakan untuk meningkatkan pertumbuhan eksplan (Dods dan Robert 1995).

Zat pengatur tumbuh (ZPT) adalah senyawa organik bukan nutrisi yang dalam knsentrasi rendah (<1 Mm) dapat mendorong, menghambat atau secara kualitatif mengubah pertumbuhan dan perkembangan tanaman. ZPT yang umum dikenal adalah auksin, giberelin, sitokinin, asam absisat, etilen, dan retardan. Senyawa-senyawa poliamin (putresin, spermidin, spermin), polifenolik, dan alcohol berantai panjang sering digolongkan dalam ZPT.

Auksin yang digunakan untuk induksi kalus adalah 2.4 D.  Senyawa 2.4 D diketahui dapat menginduksi perbanyakan sel tetapi menekan differensiasi pada tanaman dikotil. Selain itu, senyawa ini bersifat efektif untuk menginduksi embriogenesis somatik ataupun menginduksi kalus pada tanaman serealia (monokotil). Kekurangan dari auksin ini adalah kestabilan genetik. Penyimpana kalus yang lama dalam media yang mengandung auksin tersebut dapat menyebabkan meningkatnya keragaman genetik.

SIMPULAN

Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Percobaan dalam pembuatan media MS dapat dikatakan berhasil karena media yang dihasilkan tidak kontaminasi dan dapat digunakan untuk percobaan induksi kiltur embrio padi.

DAFTAR PUSTAKA

Dods JH and Robert LW. 1995. Experiment in Plant Tissue Culture. Amerika: CU Press.

Gunawan LW. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB.

Yuwono T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: UGM Press.

KULTUR EMBRIO PADI

PENDAHULUAN

Beberapa faktor penting yang mempengaruhi induksi kalus dan regenerasi tanaman yaitu pemilihan jenis eksplan, genotipe dan suplemen media yang digunakan, mencakup tipe dan kuantitas zat pengatur tumbuh, dalam hal ini auksin dan sitokinin. Komposisi auksin dan sitokinin dalam media kultur in vitro memainkan peranan penting dalam induksi dan regenerasi kalus menjadi tunas. Interaksi antara sitokinin dan auksin merupakan hal yang krusial dalam mengontrol proses pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro. Walaupun auksin berperan utama dalam pembelahan sel, namun pada beberapa tanaman, sitokinin juga sangat dibutuhkan untuk proliferasi kalus (Gunawan 1992).

Penggunaan auksin seperti 2,4-D memainkan peranan yang sangat penting dalam menginduksi dan memelihara kelangsungan pembelahan sel dan mengarahkan perkembangan sel membentuk kalus yang embriogenik, namun demikian 2,4-D juga dapat menyebabkan ketidak stabilan genetik dari materi kultur sehingga dapat menyebabkan terjadinya keragaman somaklonal. Penggunaan 2,4-D dapat menginduksi terbentuknya keragaman somaklonal dan keragaman tersebut dapat diturunkan pada generasi berikutnya. Keberhasilan dalam menginduksi dan memperbanyak kalus embriogenik harus pula diikuti oleh keberhasilan melakukan regenerasi kalus menjadi planlet. Regenerasi tunas dari eksplan kalus merupakan proses yang kompleks, karena dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya faktor genotipe, tipe eksplan dan keseimbangan zat pengatur tumbuh, dalam hal ini auksin dan sitokinin serta kondisi fisiologi kalus (Pierik 1987).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk induksi kalus pada kultur embrio padi secara aseptik dengan media MS + 2.4-D 2 ppm.

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah Bunsen, pisau scalpel, pinset, LAFC, botol kultur. Bahan yang dipergunakan adalah embrio padi, alkohol 70% dan 95%, Tween 80%, kertas wrap, plastik, karet, tisu, kertas alumunium foil, dan medium padat MS + 2.4-D 2 ppm.

METODE

Tangan diseka dengan alkohol 70% diluar LAFC. Meja dan dinding LAFC diseka dengan tisu dan alkohol 70%. Alat-alat seperti pinset, skalpel, gunting yang diperlukan dalam kultur embrio padi dicelupkan dalam alkohol 95% dan dibakar dengan api bunsen. Setelah itu alat diletakkan di atas tutup kotak stainless steel dan dibiarkan dingin. anggota tubuh yang masuk dalam LAFC disemprot dengan alkohol 70%. Embrio padi sebelumnya dibersihkan dengan air dan ditiriskan kemudian disterilisasi dalam alkohol 70% selama 30 detik. Embrio dipindahkan ke dalam bayclin 10% selama 5 menit dan bayclin 15% selama 5 menit. Masing-masing larutan ditambahkan 2 tetes Tween 80% dan dibilas dengan aquades lalu ditiriskan. Embrio padi dimasukkan dalam medium padat MS + 2.4-D 2 ppm dan ditutup dengan plastik lalu diikat dengan karet. Alat-alat yang telah dipakai direndam alkohol 95%, dibakar, dan didinginkan diatas tutup stainless steel. Setelah itu, botol medium berisi embrio padi yang diletakkan di tengah media diberi keterangan pada label.

HASIL

kontaminasi         kalus embrio padi

PEMBAHASAN

Pertumbuhan kalus yang baik dicirikan dari penampakan kalus yang berwarna bening/keputihan dan mempunyai struktur yang remah. Struktur kalus yang kompak dan terjadi perubahan warna kekuningan atau kehijauan, mengindikasikan terjadinya diferensiasi sel. Pertumbuhan kalus merupakan akibat respon terhadap zat tumbuh yang diberikan dan hormon yang terdapat dalam eksplan. Inisiasi kalus dimulai dengan pertumbuhan sel parenkim yang terletak pada bagian epidermis atau di bawah permukaan eksplan. Pertumbuhan kalus pada embrio padi ditandai dengan munculnya tonjolan–tonjolan kecil yang menyebabkan eksplan membengkak pada jaringan di sekitar luka ke bagian tengah eksplan, kemudian jaringan membesar dan mengembang serta bertambah banyak. Penambahan larutan Tween 80% pada percobaan ini berguna untuk menurunkan tegangan permukaan (Santoso & Nursandi 2003).

Pada hasil dapat terlihat bahwa pada minggu pertama sampai keempat kalus terbentuk dengan baik akan tetapi pada minggu kelima, eksplan mengalami kontaminasi. Pada minggu kelima terlihat adanya sedikit hifa berwarna putih dipermukaan media di ujung eksplan dan bundaran hitam di permukaan. Menurut Gunawan (1992), salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari eksplan, organisme kecil yang masuk ke media, botol kultur, alat tanam yang kurang steril, lingkungan kerja, ruang kultur yang kotor dan kecerobohan dalam pelaksanaan. Keanekaragaman sumber kontaminasi menyebabkan prosedur aseptik yang harus diperhatikan melalui sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat-alat dan media sterilisasi bahan tanaman.

Kontaminasi bakteri pada kultur jaringan umumnya bersifat internal. Menurut Santoso dan Nursandi (2003) bakteri internal yang terdapat dalam eksplan, responnya muncul setelah beberapa hari bahkan sampai satu bulan sehingga sangat mengecewakan, karena pada umumnya sudah terjadi induksi kalus. Salah satu metode untuk menangani kontaminasi yang sangat tinggi adalah dengan penggunaan bahan kimia yang mempunyai kemampuan untuk menghambat dan membunuh bakteri (Pierik 1987).

SIMPULAN

Pecobaan induksi kalus berhasil pada minggu kedua dan terjadi kontaminasi bakteri dan cendawan pada minggu kedua sehingga dapat disimpulkan bahwa percobaan ini belum berhasil menginduksi kalus yang steril.

DAFTAR PUSTAKA

Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB.

Pierik RLM. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Netherland: Martinus Njhoff Publisher.

Santoso U dan Nursandi F. 2003. Kultur Jaringan Tanaman. Malang: Universitas Muhammadiyah Malang.

STERILISASI EKSPLAN

PENDAHULUAN

Sterilisasi merupakan pembebasan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan mikroorganisme dalam bentuk apapun. Bahan tanaman dari lapang mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya serta spora (Gunawan 1992). Bakteri tidak saja berada pada bahan tanam bagian permukaan, tetapi pada bagian dalam bahan tanaman. Bila berada di permukaan bahan tanam respon kontaminasinya sangat cepat, dalam tempo dua kali 24 jam sudah bisa tampak kontaminasinya. Kontaminasi yang bersifat internal responnya muncul setelah beberapa hari bahkan sampai 1 bulan sehingga sangat mengecewakan karena umumnya sudah terbentuk induksi kalus (Santoso dan Nursandi 2003).

Prinsip dalam sterilisasi bahan tanam bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Bahan–bahan sterilisasi pada umumnya bersifat toksik terhadap jaringan tanaman. Pada beberapa jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida sistemik (Gunawan, 1992).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui cara sterilisasi eksplan dan melihat pertumbuhan kalus pada tanaman tembakau dan jarak pagar di media MS tanpa ZPT.

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah bunsen, pisau skalpel, pinset, LAFC, botol kultur. Bahan yang digunakan adalah tisu, detergen, aquades, alkohol 70% dan 95%, dithane, agrept, kertas wrap, plastik, karet, daun tembakau, daun muda jarak pagar, media MS tanpa ZPT, dan ruas batang jarak pagar.

METODE

Daun diambil, dicuci dengan air mengalir, detergen, dan dibilas dengan air. Agrept dan Dithane dibuat dalam 500 ml dan dibagi untuk 5 botol, daun direndam dilarutan tersebut dibilas dengan air hingga bersih. Proses di LAFC, daun direndam dalam alkohol 60 detik, bayclin 15% selama 15 menit, dibilas dengan aquades steril, direndam dalam bayclin 10% selama 10 menit, dan dibilas kembali dengan aquades. Eksplan dipotong 1×1 cm dan dimasukkan dalam media dengan cara aseptik (seperti tangan disemprot dengan alkohol 70% dan alat-alat yang telah dipakai di rendam alkohol 95% kemudian dibakar dan diletakkan pada tempatnya). Bagian bawah daun ditempelkan di permukaan media.

HASIL

Kontaminasi cendawan

Daun tembakau

PEMBAHASAN

Dalam percobaan sterilisasi eksplan digunakan agrept dan dithane. Agrept dalam percobaan ini berfungsi sebagai bakterisida. Agrept dapat membunuh bakteri yang terdapat di permukaan media. Dithane berfungsi sebagai fungisida yang dapat membunuh cendawan pada media yang digunakan. Baycline yang digunakan berfungsi sebagai desinfektan untuk membunuh bakteri. Alkohol 70% dan 95% berfungsi sebagai desinfektan dan digunakan sebelum melakukan dan sesudah bekerja di LAFC.

Tanaman yang digunakan dalam percobaan ini adalah sterilisasi adalah daun tembakau. Pada minggu kedua terlihat hifa putih yang tumbuh di dekat eksplan. Hal ini menyebabkan kontaminasi pada eksplan. Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari eksplan, organisme kecil yang masuk ke media, botol kultur , alat tanam yang kurang steril, lingkungan kerja, ruang kultur yang kotor dan kecerobohan dalam pelaksanaan. Keanekaragaman sumber kontaminasi menyebabkan prosedur aseptik yang harus diperhatikan melalui sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat-alat dan media sterilisasi bahan tanaman (Gunawan 1992).

Kontaminasi bakteri pada kultur jaringan umumnya bersifat internal. Menurut Santoso dan Nursandi (2003) bakteri internal yang terdapat dalam eksplan, responnya muncul setelah beberapa hari bahkan sampai satu bulan sehingga sangat mengecewakan, karena pada umumnya sudah terjadi induksi kalus. Salah satu metode untuk menangani kontaminasi yang sangat tinggi adalah dengan penggunaan bahan kimia yang mempunyai kemampuan untuk menghambat dan membunuh bakteri (Pierik 1987). Media kultur merupakan media yang ideal untuk pertumbuhan tanaman, namun ideal pula untuk pertumbuhan bakteri dan cendawan, oleh karena itu media kultur dan alat-alat yang akan digunakan disterilisasi terlebih dahulu. Penanaman eksplan harus dilakukan di tempat yang steril yaitu laminar air flow cabinet, dengan prosedur-proseder aseptik yang telah ditentukan (Beyl 2000).

Faktor lain yang dapat menyebabkan kontaminan adalah udara sehingga udara dalam ruang kultur perlu dijaga agar tetap bersih. Diperlukan adanya aliran udara yang bertekanan dari dalam ke luar ruangan agar terjadi pertukaran udara yang bebas dari kontaminasi. Kelembaban relatif lingkungan kultur dapat diatur. Kelembaban ruang kultur yang tinggi akan menyebabkan terjadinya pertumbuhan mikroba yang akan mengkontaminasi kultur dan alat-alat laboratorium.

SIMPULAN

Percobaan kali ini dapat dikatakan belum berhasil karena pada minggu kedua eksplan mengalami kontaminasi oleh cendawan. Kontaminasi dapat berasal dari eksplan, organisme kecil yang masuk ke media, botol kultur , alat tanam yang kurang steril, lingkungan kerja, ruang kultur yang kotor dan kecerobohan dalam pelaksanaan.

DAFTAR PUSTAKA

Beyl B. 2000. Getting Started with Tissue Culture – Media Preparation, Sterile Technique and laboratory Equipment. London: CRC Press.

Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB.

Pierik RLM 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Netherland: Martinus Njhoff publisher.

Santoso U dan Nursandi F. 2003. Kultur Jaringan Tanaman. Malang: Universitas Muhammadiyah Malang.

SUBKULTUR

PENDAHULUAN

Sub kultur merupakan pemindahan kultur dari media lama ke media yang baru untuk memperoleh pertumbuhan baru yang didinginkan. Perlakuan sub kultur dapat disebabkan beberapa alasan seperti:

  • pertumbuhan kultur yang cepat dan sudah memenuhi botol
  • kultur perlu diperbanyak untuk tujuan perbanyakan
  • terjadi proses browning terutama pada awal inisiasi
  • media kultur mengering (agar-agar berkurang) atau nutrient mulai habis/media sudah habis
  • kultur telah menunjukkan gejala defisiensi.

Sub kultur merupakan tahap kegiatan yang relatif mudah. Kita tidak perlu melakukan sterlisasi karena dilakukan pada tanaman yang sudah steril dalam botol. Jadi tidak perlu fungisida, bakterisida, cairan pemutih dan bahan-bahan sterlisasi yang lain. Yang perlu disiapkan adalah alat-alat standar seperti pisau, pinset dan petri dish yang steril dan media tumbuh baru (botolan).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk multiplikasi tunas tanaman nenas Bangka dan anggrek pada media MS + BAP 0.5 ppm + IAA 0.1 ppm.

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah bunsen, pisau skalpel, pinset, LAFC, botol kultur, dan alat tulis. Bahan yang dgunakan adalah medium MS+BAP 0,5 mg/L, tisu, alkohol 70% dan 95%, kertas wrap, karet, plastik.

METODE

Alat dan bahan disterilisasi, anggota tubuh yang masuk dalam LAFC disemprot dengan alkohol 70%. Tunas nenas diambil sebanyak 2-3 tunas dalam cawan petri dengan pisau. Tunas dimasukkan dalam medium MS+BAP 0,5 mg/L dan ditutup. Alat-alat yang telah dipakai direndam alkohol 95%, dibakar, dan didinginkan diatas tutup stainless steel. Setelah itu, botol medium berisi eksplan diberi keterangan pada label.

HASIL

Tunas tumbuh di sela-sela daun

Multiplikasi tunas tanaman nenas bangka

PEMBAHASAN

Satu hal yang perlu diperhatikan dalam memilih saat sub kultur adalah jangan sampai telat menentukan saat subkultur yang paling tepat. Jika sub kultur telat dilakukan atau usia eksplan sudah tua dalam botol maka hasilnya tidak begitu bagus. Multiplikasi ini bertujuan untuk perbanyakan pucuk/tunas/klon tanaman dan meningkatkan terjadinya percabangan aksial dan pembentukan pucuk secara adventif. Maksud dari multiplikasi adalah memindahkan tunas-tunas dari dalam wadah kultur secara aseptik yang tumbuh dari hasil induksi dan ditanam kembali dalam botol kultur lain yang berisi media serta hormon yang mampu merangsang pertunasan.

Pada percobaan ini, kelompok kami hanya mendapatkan multiplikasi tunas untuk tanaman nenas Bangka. Multiplikasi tunas telah berhasil dilakukan. Tunas baru terlihat tumbuh pada minggu kedua. Tunas muda tersebut terdapat di sela-sela daun. Tunas semakin bertambah banyak sampai minggu selanjutnya dan tidak terlihat adanya kontaminasi.

Multiplikasi dapat dirangsang dengan melakukan modifikasi media tanam baik jenis maupun bentuknya (padat atau cair) dan modifikasi hormon (jenis dan konsentrasinya). Umumnya, multiplikasi dilakukan apabila ingin mendapatkan eksplan dalam jumlah besar. Multiplikasi dapat dilakukan dengan mengeluarkan eksplan dari botol lalu dimasukkan dalam cawan petri. Eksplan dipotong-potong dengan skalpel dan pinset yang steril. Potongan tadi kemudian dimasukkan dalam media multiplikasi yaitu MS0+(0.5-2 mg/L BAP).

SIMPULAN

Multiplikasi tunas dapat digunakan untuk perbanyakan pucuk/tunas/klon tanaman dan meningkatkan terjadinya percabangan aksial dan pembentukan pucuk secara adventif. Percobaan multiplikasi tunas pada tanaman nenas Bangka berhasil dilakukan karena tunas baru tumbuh di sela-sela daun pada minggu kedua dan bertambah banyak pada minggu selanjutnya.

DAFTAR PUSTAKA

Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB.


KULTUR STEK BATANG: STEK BUKU TUNGGAL TANAMAN KRISAN DENGAN IAA DAN NAA

PENDAHULUAN

Perbanyakan krisan secara vegetatif biasa dilakukan melalui stek pucuk, anakan dan kultur jaringan. Perbanyakan krisan secara kultur jaringan dapat menghemat waktu dan dapat diperoleh jumlah bibit krisan banyak. Menurut Trigiano dan Gray (2000) terdapat 4 tahap dalam kultur jaringan tanaman yaitu tahap inisiasi, proliferasi tunas, pengakaran dan aklimatisasi. Tahap inisiasi mencakup persiapan eksplan, sterilisasi eksplan hingga mendapatkan eksplan yang bebas dari kontaminasi. Tahap proliferasi tunas adalah tahap pertumbuhan dan perkembangan tunas sehingga dihasilkan tunas yang sehat, steril dan siap dipindahkan ke media pengakaran. Pada tahap pengakaran, eksplan yang telah bertunas ditanam dalam media dengan zat pengatur tumbuh untuk menghasilkan akar. Setelah tanaman berakar, tanaman dipindahkan ke lapang yang sebelumnya diadaptasikan dahulu pada tahap aklimatisasi.

Zat pengatur tumbuh dibutuhkan dalam konsentrasi yang rendah. Fungsi dari zat pengatur tumbuh adalah untuk merangsang inisiasi, perkembangan tunas dan akar pada eksplan baik dalam media padat atau cair (Beyl 2000). Zat pengatur tumbuh mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ (Gunawan 1992). Auksin merupakan salah satu zat pengatur tumbuh yang berfungsi untuk pemanjangan sel dan pembesaran jaringan, dominasi apikal, pembentukan akar dan somatik embriogenesis (Beyl 2000). Auksin digunakan untuk pertumbuhan kalus, suspensi sel dan organ. Jenis auksin yang umum digunakan adalah IAA, NAA, dan IBA. Pemilihan jenis auksin dan konsentrasinya tergantung dari tipe pertumbuhan yang dikehendaki, level auksin endogen, kemampuan mensintesa auksin dan golongan zat tumbuh lain yang ditambahkan (Gunawan 1992).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk membedakan efek zat pengatur tumbuh auksin antara IAA dan NAA pada tanaman krisan.

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah bunsen, pisau skalpel, pinset, LAFC, botol kultur, dan alat tulis. Bahan yang dgunakan adalah media stek batang krisan, MS+IAA/NAA 0,1 mg/L, alkohol 70% dan 95%, tisu, kertas wrap, plastik, karet.

METODE

Alat dan bahan disterilisasi, anggota tubuh yang masuk dalam LAFC disemprot dengan alkohol 70%. Buku tanaman krisan distek (dipotong menggunakan pisau) dengan bagian bawah lebih panjang. Stek batang ditancapkan kedalam media MS+IAA/NAA 0,1 mg/L. Alat-alat yang telah dipakai direndam alkohol 95%, dibakar, dan didinginkan ditas tutup stainless steel. Setelah itu, botol medium berisi eksplan diberi keterangan pada label dan diamati selama beberapa minggu.

HASIL

tunas aksilar tumbuh cepat                             tunas aksilar tumbuh lambat

Media IAA dan dengan daun                          Media NAA dan tanpa daun

pada minggu ke-2                                              pada minggu ke-2

PEMBAHASAN

Stek buku tunggal tanaman krisan dengan media MS+IAA dan MS+NAA berhasil tumbuh membentuk tunas atau tajuk, hal ini sesuai dengan tujuan penggunaan IAA dan NAA yaitu untuk multiplikasi tunas atau tajuk. Pada eksplan krisan yang ditumbuhkan pada media NAA terdapat pertumbuhan yang berbeda dengan IAA. Pada media ini eksplan krisan berhasil tumbuh, akan tetapi tunas yang dihasilkan lebih lama dibandingkan dengan media IAA. Tetapi tujuan penggunaan NAA untuk induksi perakaran tidak tercapai karena tidak tidak ditemukan tumbuhnya akar pada eksplan. Eksplan krisan yang dikulturkan berhasil tumbuh tunas lateral yang membentuk percabangan sesuai dengan tujuan penggunaan IAA dan NAA yang menginduksi pertumbuhan tunas atau tajuk. Lamanya pertumbuhan tunas baru pada media NAA juga dapat disebabkan perlakuan pemotongan daun pada salah satu cabang. Pemotongan daun pada eksplan dapat mengurangi kadar auksin endogen yang terdapat dalam tanaman tersebut sehingga memperlambat pembentukan tunas pada media MS+NAA yang salah satu daunnya dipotong.

Auksin (IAA) dalam budidaya jaringan berperan dalam mempengaruhi perkembangan dan pembesaran sel, sehingga tekanan dinding sel terhadap protoplasma berkurang. Hal ini mengakibatkan protoplas dapat mengabsorbsi air di sekitar sel, sehingga sel menjadi panjang terutama sel-sel di bagian maristem. Di sisi lain NAA juga dapat mendorong terbentuknya sejumlah sel yang cukup banyak tetapi tidak membelah, kumpulan dari sel ini yang disebut kalus. Kalus terbentuk karena terjadinya penumpukan sel-sel yang mengembang akibat dari masuknya air, unsur hara dan ZPT ke dalam sel, semua bahan tersebut tidak dapat disebarkan ke seluruh tubuh tanaman seperti akar, batang, dan daun, sehingga berkumpul di satu titik.

Pada percobaan ini IAA diberikan kembali pada media karena IAA endogen belum cukup untuk menginduksi eksplan membentuk tunas disebabkan terajadinya penguraian pada proses sterilisasi dengan menggunakan suhu tinggi (autoclave) dan terkena cahaya lampu pada rak tumbuh. Penggunaan auksin dalam budidaya jaringan umumnya memberikan respon terhadap pemanjangan sel, pembentukan kalus, dan akar adventif, sedangkan pada konsentrasi tinggi

mendorong pembentukan kalus saja.

SIMPULAN

Auksin IAA dan NAA yang diberikan pada medium dapat merangsang tumbuhnya tunas aksilar yang terdapat pada ketiak daun. Pertumbuhan tunas aksilar pada IAA lebih cepat dari NAA. Tanaman yang salah satu cabang dipotong daunnya juga mempengaruhi kecepatan pertumbuhan tunas aksilar.

DAFTAR PUSTAKA

Beyl B. 2000. Getting Started with Tissue Culture – Media Preparation, Sterile Technique and laboratory Equipment. London: CRC Press.

Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB.

Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Introduction to Plant Tissue Culture. London: CRC Press.


KULTUR STEK BATANG: STEK BUKU TUNGGAL TANAMAN KRISAN DENGAN KINETIN DAN BAP

PENDAHULUAN

Dalam kultur jaringan sangat diperlukan zat pengatur tumbuh untuk merangsang pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ (Gunawan 1992). Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah sitokinin dan auksin. Sitokinin yang biasa digunakan adalah 6-Benzil Amino Purin (BAP) dan kinetin. Sitokinin adalah zat pengatur tumbuh yang berfungsi dalam mendorong pembentukan sel, merangsang inisiasi dan pertumbuhan tunas. Sitokinin dalam konsentrasi yang tinggi dapat menginduksi pembentukan tunas, namun menghambat pertumbuhan akar (Beyl 2000). Disamping merangsang pembentukann tunas adventif, sitokinin juga merangsang multiplikasi tunas aksilar dan melawan dominasi apikal. Interaksi dan perimbangan antara auksin dan sitokinin yang diberikan dalam medium dan yang diproduksi secara endogen oleh tanaman, menentukan arah perkembangan suatu kultur yang ditanam (Gunawan 1992).

Sitokinin dalam hal ini Kinetin dapat berperan dalam mendorong morfogensis sel. Proses perpanjangan sel (fase G1 dalam pertumbuhan sel) berlangsung baik karena terpenuhi kebutuhan nutrisinya . Adanya kinetin yang ditambah pada media tumbuh mengakibatkan fase transkripsi dan translasi RNA berlangsung lebih giat, yang selanjutnya akan bertambah giat memasuki fase pembesaran sel (G2) ke fase pembelahan sel. BAP dalam kultur jaringan umumnya berperan dalam perbentukan tunas baik itu tunas aksilar, maupun adventif.

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk membedakan efek zat pengatur tumbuh sitokinin antara kinetin dan BAP pada tanaman krisan.

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah bunsen, pisau skalpel, pinset, LAFC, botol kultur, dan alat tulis. Bahan yang dgunakan adalah media stek batang krisan, MS+IAA/NAA 0,1 mg/L, alkohol 70% dan 95%, tisu, kertas wrap, plastik, karet.

METODE

Alat dan bahan disterilisasi, anggota tubuh yang masuk dalam LAFC disemprot dengan alkohol 70%. Buku tanaman krisan distek (dipotong menggunakan pisau) dengan bagian bawah lebih panjang. Stek batang ditancapkan kedalam media MS + kinetin 0,1 mg/L atau BAP 0,1 mg/L. Alat-alat yang telah dipakai direndam alkohol 95%, dibakar, dan didinginkan di atas tutup stainless steel. Stelah itu, botol medium berisi eksplan diberi keterangan pada label dan diamati selama beberapa minggu.

HASIL

tunas aksilar                                                                 kontaminasi

Media MS+BAP 0,1 mg/L                                      MS +kinetin 0,1 mg/L

Minggu ke-3                                                           Minggu ke-2

PEMBAHASAN

Berdasarkan hasil pengamatan selama 3 minggu, diketahui kultur stek batang krisan dengan media MS+BAP dapat tumbuh tunas aksilar pada minggu ketiga. Tunas baru tersebut terlihat baik dan tidak terkontaminasi oleh cendawan dan bakteri. Pada stek batang dengan medium MS+kinetin terjadi kontaminasi oleh cendawan pada minggu kedua. Hal ini ditandai adanya hifa-hifa putih di permukaan medium. Pada percobaan ini, stek batang yang digunakan tidak memotong bagian daun pada

Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi yang terjadi pada media MS+kinetin dapat berasal dari eksplan, organisme kecil yang masuk ke media, botol kultur , alat tanam yang kurang steril, lingkungan kerja, ruang kultur yang kotor dan kecerobohan dalam pelaksanaan. Keanekaragaman sumber kontaminasi menyebabkan prosedur aseptik yang harus diperhatikan melalui sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat-alat dan media sterilisasi bahan tanaman (Gunawan 1992).

Sitokinin sendiri biasanya digunakan untuk merangsang pembelahan sel, terutama bila ditambahkan bersama dengan auksin. Penggunaan BAP dalam konsentrasi tinggi dapat merangsang kemampuan tumbuhan dalam pembentukan tunas. Konsentrasi BAP yang diberiakan dan adanya sitikonin endogen dalam eksplan akan mempengaruhi pembelahan sel pada sel-sel meristem yang juga akan mempengaruhi pertumbuhan dari eksplan. Perlakuan pemberian BAP dan kinetin tidak mempengaruhi presentase kontaminasi yang terjadi karena umumnya kontaminasi terjadi karena cendawan, bakteri, proses pelaksaan dan lingkungan. Pada kultur jaringan tanaman dimana eksplan merupakan tunas pucuk atau stek maka sitokinin dapat mendorong proliferasi  tunas. Dari ketiak stek yang umumnya keluar satu tunas maka dengan penambahan sitokinin dengan konsentrasi tertentu dapat merangsang terjadinya proliferasi.

SIMPULAN

Percobaan stek batang tanaman krisan pada media MS+BAP berhasil mengalami pertumbuhan tunas pada ketiak daun pada minggu ketiga, sedangkan stek batang krisan pada media MS+kinetin mengalami kontaminasi cendawan pada minggu kedua. Kontaminasi ditandai dengan adanya hifa pada permukaan media di bagian tengah.

DAFTAR PUSTAKA

Beyl B. 2000. Getting Started with Tissue Culture – Media Preparation, Sterile Technique and laboratory Equipment. London: CRC Press.

Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB.

Comments are closed.